悬浮细胞的siRNA转染步骤

悬浮细胞因其生长特性与贴壁细胞不同，siRNA转染需针对其生理特征优化操作流程。本文结合实验经验，系统解析悬浮细胞siRNA转染的关键步骤，为科研人员提供实用参考。

一、细胞培养与预处理

1. 细胞状态控制：选择对数生长期的健康悬浮细胞，避免老化或污染。细胞密度建议控制在每孔（24孔板）1×10⁵~2×10⁵个，确保转染时细胞活性。

2. 培养基调整：转染前12-24小时，将细胞转移至无血清或低血清培养基（如Opti-MEM）中，降低脂质体试剂毒性影响。

3. 离心洗涤：使用PBS缓冲液清洗细胞1-2次，去除残留培养基杂质，避免干扰转染复合物形成。

二、转染试剂复合物制备

1. siRNA与转染试剂稀释

• 将siRNA储存液（20μM）用无RNA酶的ddH₂O或Opti-MEM稀释至工作浓度（50-200nM）。   

• 按说明书比例将转染试剂与无血清培养基混合，室温静置5-10分钟使试剂充分激活。

2. 复合物形成

• 将稀释后的siRNA溶液缓慢加入转染试剂溶液中，避免剧烈震荡。      

• 室温孵育15-30分钟，使siRNA与转染试剂充分结合形成稳定的复合物。

三、转染操作流程

1. 细胞重悬：将预处理后的悬浮细胞用无血清培养基重悬，调整密度至60%-80%。

2. 复合物加入：将制备好的转染复合物滴加至细胞悬液中，轻轻混匀后转移至培养容器。

3. 培养条件：置于37℃、5% CO₂培养箱中孵育4-6小时后，更换为含血清的完全培养基以降低毒性。

四、转染效果检测

1. mRNA水平检测

• 转染后24-48小时提取总RNA，通过qRT-PCR检测靶基因mRNA表达水平。      

• 引物设计需覆盖siRNA靶序列两侧，以提高检测灵敏度。

2. 蛋白水平检测

• 转染后48-72小时收集细胞蛋白，采用Western Blot分析靶蛋白表达变化。      

• 注意：蛋白半衰期差异可能导致结果滞后，建议多时间点取样。

五、优化与注意事项

• 细胞密度需严格把控，过高或过低均影响转染效率。

• 脂质体类试剂毒性较大，建议选择悬浮细胞专用转染试剂。

• 若转染效率低，可尝试电穿孔或纳米材料转染技术。

总结

悬浮细胞的siRNA转染需兼顾细胞特性与试剂适配性，通过优化培养条件、复合物配比及检测方法，可显著提升实验成功率。掌握标准化流程并灵活调整参数，是实现高效基因沉默的关键。