一、引言

在生命科学研究中，了解基因的功能及其在细胞生理和病理过程中的作用至关重要。RNA 干扰（RNAi）技术作为一种强大的工具，通过导入小干扰 RNA（siRNA）来特异性地沉默目标基因的表达，已在基因功能研究、疾病机制探索和药物研发等领域得到广泛应用。对于悬浮细胞而言，其独特的生长特性使得 siRNA 转染过程具有一定的挑战性。因此，明确和优化悬浮细胞的 siRNA 转染步骤对于成功实现基因沉默和获得有意义的实验结果具有重要意义。

二、实验材料与设备

（一）实验材料

悬浮细胞系：根据研究目的选择合适的悬浮细胞系，如血液细胞系（如淋巴细胞、白血病细胞等）、肿瘤细胞系（如淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞等）。确保细胞处于良好的生长状态，无微生物污染。

siRNA：针对目标基因设计合成的 siRNA，其序列应经过严格的筛选和验证，以确保具有高效的基因沉默效果。同时，需准备阴性对照 siRNA，用于排除非特异性转染效应。

转染试剂：选择适用于悬浮细胞的转染试剂，常见的有脂质体转染试剂、阳离子聚合物转染试剂等。不同的转染试剂具有不同的转染效率和细胞毒性，需根据细胞类型和实验要求进行选择。

细胞培养基：适合所选悬浮细胞生长的培养基，通常包含必需的营养成分、生长因子和血清等。培养基应在无菌条件下配制和保存。

无菌 PBS（磷酸盐缓冲液）：用于洗涤细胞，保持细胞的渗透压和 pH 稳定。

细胞培养耗材：如培养瓶、离心管、移液器吸头、培养板等，均需经过高压灭菌处理，确保无菌。

（二）实验设备

细胞培养箱：提供适宜的温度（通常为 37°C）、湿度（通常为 95%）和二氧化碳浓度（通常为 5%），以维持细胞的正常生长和代谢。

离心机：用于细胞的离心收集和洗涤，转速和离心时间需根据细胞类型和实验要求进行调整。

倒置显微镜：用于观察细胞的形态和生长状态，在转染过程中可实时监测细胞的健康状况。

移液器：包括不同量程的单道移液器和多道移液器，用于准确量取细胞悬液、培养基和转染试剂等。

无菌操作台：提供无菌操作环境，防止微生物污染实验样品。

荧光显微镜（可选）：如果使用带有荧光标记的 siRNA 或转染试剂，可通过荧光显微镜观察转染效率和细胞内 siRNA 的分布情况。

三、转染步骤

（一）细胞培养与计数

在无菌条件下，将悬浮细胞接种于合适的培养瓶或培养板中，加入适量的细胞培养基，轻轻摇匀，使细胞均匀分布。

将细胞培养物置于细胞培养箱中，在适宜的条件下培养，定期观察细胞的生长状态，确保细胞处于对数生长期。

在转染前，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，根据实验要求调整细胞浓度至合适的范围（通常为 [X] - [X] cells/mL）。

（二）siRNA 与转染试剂的准备

siRNA 稀释：根据实验设计，将所需量的 siRNA 干粉溶解于适量的无 RNA 酶的 ddH₂O 或专用的 siRNA 稀释缓冲液中，轻轻混匀，制备成一定浓度的 siRNA 储存液（通常为 20 μM）。然后，将 siRNA 储存液进一步稀释至工作浓度（通常为 50 - 200 nM），可根据转染试剂的说明书和细胞类型进行优化。

转染试剂稀释：按照转染试剂说明书的要求，将转染试剂用无血清的细胞培养基稀释至适当的浓度。一般情况下，转染试剂与 siRNA 的比例需通过预实验进行优化，以达到最佳的转染效率和最小的细胞毒性。

（三）siRNA - 转染试剂复合物的形成

在无菌离心管中，将适量稀释后的 siRNA 溶液与等体积或相应比例的稀释后的转染试剂溶液轻轻混合，避免剧烈振荡，以免破坏复合物的形成。

将混合液在室温下孵育一定时间（通常为 15 - 30 分钟），使 siRNA 与转染试剂充分结合，形成稳定的 siRNA - 转染试剂复合物。

（四）细胞转染

将培养中的悬浮细胞轻轻摇匀，吸取适量的细胞悬液（根据实验要求和细胞密度确定）转移至新的无菌离心管中。

将预先制备好的 siRNA - 转染试剂复合物缓慢滴加到含有细胞悬液的离心管中，边滴加边轻轻摇匀，使复合物均匀分布于细胞悬液中。

将转染后的细胞悬液转移回培养瓶或培养板中，轻轻摇匀，然后将培养物置于细胞培养箱中，在适宜的条件下继续培养。

（五）转染后培养与检测

转染后培养：根据细胞类型和实验目的，确定转染后的培养时间。在培养过程中，定期观察细胞的生长状态和形态变化，如有必要，可更换新鲜的细胞培养基，以维持细胞的正常生长和代谢。

转染效果检测：在转染后的适当时间点，可通过多种方法检测 siRNA 的转染效果和目标基因的沉默效率。

荧光检测（如果使用荧光标记的 siRNA 或转染试剂）：使用荧光显微镜观察细胞内的荧光信号，评估转染效率。通过计算发出荧光的细胞数占总细胞数的比例，可得到大致的转染效率。

qRT - PCR 检测：提取转染后细胞的总 RNA，反转录为 cDNA，然后利用实时荧光定量 PCR 技术检测目标基因的 mRNA 表达水平。与未转染或阴性对照转染的细胞相比，目标基因 mRNA 表达水平显著降低表明 siRNA 成功沉默了目标基因。

Western blot 检测：收集转染后细胞的蛋白质，通过 Western blot 技术检测目标蛋白的表达水平。目标蛋白表达量的减少可进一步证实 siRNA 对目标基因的沉默效果。

四、注意事项与优化策略

（一）注意事项

细胞质量控制：确保使用的悬浮细胞处于良好的生长状态，无微生物污染和其他异常情况。定期对细胞进行传代培养，避免细胞老化对转染效率和实验结果的影响。

实验操作规范：在整个转染过程中，严格遵守无菌操作原则，防止微生物污染。使用无 RNA 酶的耗材和试剂，避免 RNA 降解。操作过程中尽量减少对细胞的机械损伤，保持细胞的完整性。

转染试剂选择与优化：不同的悬浮细胞系对转染试剂的敏感性和适用性不同。在选择转染试剂时，需参考其说明书和相关文献，了解其对特定细胞类型的转染效率和细胞毒性。同时，通过预实验优化转染试剂与 siRNA 的比例、转染时间和细胞密度等参数，以提高转染效率并降低细胞毒性。

siRNA 质量控制：合成的 siRNA 应具有较高的纯度和完整性。在使用前，可通过琼脂糖凝胶电泳等方法检测 siRNA 的质量，确保其无降解和杂质污染。同时，注意 siRNA 的保存条件，避免反复冻融。

（二）优化策略

优化细胞密度：适当调整转染时的细胞密度，过高或过低的细胞密度都可能影响转染效率。一般来说，需通过预实验确定每种细胞系的最佳转染细胞密度。

选择合适的转染方法：除了常规的脂质体转染和阳离子聚合物转染外，还有电穿孔转染、病毒载体介导的转染等方法可供选择。对于某些难以转染的悬浮细胞系，可尝试不同的转染方法，以找到最适合的转染方式。

使用转染增强剂：在转染过程中，可添加一些转染增强剂，如细胞松弛素 B、氯喹等，来提高转染效率。但需注意转染增强剂的浓度和作用时间，避免对细胞造成过度损伤。

优化培养条件：调整转染后的培养条件，如培养基成分、培养温度和二氧化碳浓度等，也可能对转染效果产生影响。例如，某些细胞在较低的温度下培养可能有助于提高转染效率。

五、结论

悬浮细胞的 siRNA 转染是一项复杂而关键的实验技术，需要严格的实验操作和优化策略。通过合理选择实验材料和设备，准确掌握转染步骤，注意实验中的各项细节，并不断优化转染条件，研究人员可以实现高效的基因沉默，为深入研究基因功能和相关生物学过程提供有力的技术支持。同时，随着生命科学技术的不断发展，新的转染试剂和方法不断涌现，研究人员应持续关注和学习，不断改进和完善悬浮细胞的 siRNA 转染技术，以适应不同的研究需求和挑战。